实验：细菌基因组DNA 的提取1目录一、实验目的二、实验原理三、仪器、试剂四、实验方法和步骤五、实验注意事项六、DNA 提取常见问题七、问题与讨论2一、实验目的学会细菌基因组DNA 的提取方法观察提取出来的DNA 物质3二、实验原理 DNA 在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。在碱性条件下，用表面活性剂SDS 将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的DNA 。4三、仪器、试剂1 、仪器 离心管、离心机、试管、吸量管2 、试剂（1 ）活材料：大肠杆菌（E.coli ）或枯草杆菌（Bacillus subtilis ）（2 ）培养基：LB 液体培养基（3 ）溶菌酶：100μg/ml（4 ）裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L 乙酸钠，1mol/LEDTA ，1%SDS5（5 ）1%SDS （十二烷基硫酸钠）：1gSDS 溶于100ml 蒸馏水，灭菌后-4℃保存（6 ）mol/LNaCl ：称取292.5gNaCl ，溶于1000ml蒸馏水，灭 菌后-4℃保存。（7 ）无水乙醇及70% 乙醇（8 ）超纯水（9 ）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl ， 1mmol/LEDTA-Na2 （pH ：8.0 ）（10 ）饱和酚（11 ）氯仿：异戊醇（25 ：1 ）6四、实验方法和步骤1 、DNA 提取的一般方法破碎细胞提取纯化I. 材料准备II. 破碎细胞或包膜－内容物释放III. 核酸分离、纯化IV. 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V. 核酸溶解在适量缓冲液或水中7四、实验方法和步骤2 、DNA 提取的实验步骤菌体培养37 ℃、16—18h菌体收集12000r/min 、30sNaCl充分混匀12000r/min ，10min弃上清液200μL 裂解缓冲液转移上清置新离心管加Tris 饱和苯酚混匀12000rmin ，3min取水层加氯仿混匀12000r/min 、3min取上层清液加无水乙醇12000r/min 、3min弃上清沉淀加400μL70% 乙醇洗两次真空干燥溶解DNA-20 ℃冰箱8五、实验注意事项1 、材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA 量少，纯度低。2 、采用有机（酚/ 氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。3 、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。4 、沉淀后应用70 ％的乙醇洗涤，以除去盐离子等。5 、晾干DNA ，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。91 、DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2 、DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3 、DNA 中残留有金属离子1 、重新纯化DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2...
